MTT法作为一种经典的细胞活力检测技术，其原理基于活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶将MTT检测细胞增殖凋亡还原为蓝紫色甲瓒结晶，通过酶标仪测定吸光度(OD值)间接反映细胞数量或活性。然而，实验中OD值异常是常见问题，可能由以下原因导致：
1. 细胞接种密度不当
问题：细胞浓度过高会导致培养基营养耗竭，细胞进入G0期甚至死亡；浓度过低则OD值接近空白对照，误差占比较大。
解决方案：预实验需优化接种密度，并通过标准曲线确定线性范围。
2. MTT试剂配制与保存错误
问题：
MTT检测细胞增殖凋亡粉末未充分溶解或滤菌不完，可能导致沉淀残留干扰吸光度；反复冻融或保存不当会使试剂失效，呈现灰绿色。
解决方案：现用现配较佳，若需保存，分装为小剂量于20℃避光保存，避免反复冻融。使用时确保MTT溶液为黄色澄清状，若变色则立即弃用。
3. 边缘效应与蒸发影响
问题：96孔板边缘孔因水分蒸发快、气体交换不均，易出现OD值偏高或偏低。
解决方案：边缘32孔填充无菌PBS，中间孔用于实验；加样时避免气泡，操作尽量快速以减少蒸发差异。
4. 药物与MTT直接反应
问题：具有氧化还原性的药物(如维生素C、谷胱甘肽)会直接还原MTT生成棕褐色沉淀，导致假阳性结果。
解决方案：加药前用PBS清洗细胞2~3次去除残留药物，或改用CCK8法避免干扰。
5. DMSO溶解不完
问题：甲瓒结晶未充分溶解会导致吸光度偏低且数据波动大。悬浮细胞离心后吸上清时可能误吸结晶，贴壁细胞倾斜角度不足也会残留结晶。
解决方案：贴壁细胞可倾斜30°缓慢吸液，悬浮细胞需离心后吸上清；DMSO溶解后37℃孵育10~20min并振荡10min，确保结晶溶解。
6. 污染与操作失误
问题：细菌或真菌污染会消耗营养并改变培养基pH，导致OD值异常升高；加MTT后立即变蓝黑色提示污染。此外，移液器精度不足或复孔设置过少(<3个)也会增加误差。
解决方案：实验前镜检确认无污染；使用校准过的移液器，关键步骤重复3~5个复孔；调零孔与对照孔需严格设置以排除培养基和溶剂干扰。
总结
MTT检测细胞增殖凋亡实验的可靠性依赖于细节把控。若OD值异常，需从细胞状态、试剂质量、操作规范三方面排查。对于特殊药物或敏感细胞系，建议结合ATP测定法、LDH法等交叉验证，以提高结果准确性。
